三七二醇皂昔對大腦中動(dòng)脈梗塞大鼠行為學(xué)病理形態(tài)學(xué)及血清白細胞介素一6的影響

摘要:目的:探討三七三醇皂苷對大鼠腦梗死后不同恢復時(shí)點(diǎn)相關(guān)病理門(mén)理改變及對血_清白細胞介素-6(工L -6)水平的形響。力一法:采用線(xiàn)栓法制備大腦中動(dòng)脈梗塞大鼠模型啊ACO)，研究三七三醇皂苷對大腦中動(dòng)脈梗塞大鼠腦缺血_后不同時(shí)問(wèn)點(diǎn)的行為障礙、缺血_組織病理形態(tài)及血_清白細胞介素-6水平的Y響。結果:阻}析大腦中動(dòng)脈后3d內，所有大鼠都出現程度不同的運動(dòng)障礙，血_清工L-6水平顯著(zhù)川高。三七三醇皂苷可減輕MCAO大鼠神經(jīng)功能損傷表現，部分改善其活動(dòng)度，明顯抑制其血_清中工L-6水平。結論:三七三醇皂苷能有效抑制級聯(lián)反應中炎性細胞囚了幾-6的產(chǎn)門(mén)，減輕或消除腦缺血_級聯(lián)反應中的炎鄉l補反應，發(fā)揮保護神經(jīng)兀的作用。

關(guān)鍵詞:三七三醇皂苷 腦梗死 白細胞介素-6 大腦中動(dòng)脈梗塞大鼠模型 實(shí)驗研究

Effect of PTS on praxiology, pathomorphology and serum IL一6 in rats with middlecerebral artery occlusion

ZOU Wei-meng, ZHA工.Jian wing, CU工Fang yuan, WANG Xi-ling, ZHU Ling-qun, ZOU Yi-huai(Dongzhimen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100700, China)Abstract: Objectivee To investigate the effect of PTS on the related pathophysiological changes and serum ILr6 levelat different time points after the middle cerebral artery occlusione MCAOe in rat's brain. Methodse The model of focal cerebralischemia of rat was established by the suture-occluded method.The effect of PTS on the behavioral disturbance，the pathologicalchange of ischemia tissue and the level of serum IL-6 at different time points(3d,7d,28d) after MCAO and cerebral ischemia inrats were studied. Resultse After MCAO,different degrees of motion disturbances were observed in all rats. The infarct spot canbe observed in all groups except the normal. The nerve cell necrosis can be found in all rats after 24 hour of MCAO. The resultshowed that PTS could improve the degree of motion disturbance ,reduce the infarct spot obviously; after MCAO, the serumILr6 were increased obviously but could be reduced by PTS. Conclusione PTS can protect the neurons，reduce and eliminate theinflammatory reaction of cerebral ischemia cascade reaction effectively, which may relate to its inhibiting effect on cell factorssuch as ILr6 production after cerebral ischemia

Key WOrdS: PTS; Cerebral ischemia; IL-6; MCAO; Experimental study

中藥三七活血化淤而不傷正氣，用十腦梗死的臨床治療取得了較好療效。木研究通過(guò)觀(guān)察三一L提取物三一L三醇皂昔(P T S)在不同時(shí)一間點(diǎn)對大腦中動(dòng)脈梗塞大鼠模型(m fiddle cerebral artery occhtsion,M CAO)的行為學(xué)、病理形態(tài)學(xué)和抑制炎性介質(zhì)方ICI的影響，探討PTS促進(jìn)腦梗死后功能恢復的機制，為治療腦梗死后不同時(shí)一點(diǎn)的作用提供新的實(shí)驗依據。

材料和方法

1.實(shí)驗動(dòng)物健康雄性SD大鼠105只，體質(zhì)量0300士20} g,清潔級，購自北京維通利華實(shí)驗動(dòng)物技術(shù)有卜良公司，許可證號:SCX K(京)2002-00030

2.藥物與試劑三七通舒膠囊:成都華神集團股份有限公司制藥)一生產(chǎn)(國藥準字220030109;產(chǎn)nuu批號:061002 X H 021;規格:何粒200m g，含PTS 100m g)。尼莫地平片:天津市中火藥業(yè)有限公司生產(chǎn)(Ir}藥準字H 200439150;產(chǎn)uu扎匕號:060608;規格:何)'; 30m g)。R at IL-6 E L ISA試劑盒:美國加利弗尼業(yè)州R ap i}l B io L ab產(chǎn)u (C a七N o.3R 035，產(chǎn)uu扎匕號:10090522)，購自尚柏生物醫學(xué)技術(shù)(北京)有n}公司。

3.儀器與設備SPO T-II數碼成像系統((d iagn-ostic instsum tints公司);石蠟切片機(德國L eicaR M 2135);光學(xué)顯微鏡(日木OLYMPUS BX60型);128C型C tin ih io全自動(dòng)酶標儀;L D 5-2A型離心機(北京醫用離心機)一)。

4.方法將大鼠稱(chēng)質(zhì)量后隨機分為正常組和手術(shù)組。手術(shù)組采用改良的L ongaT法制備M CAO模型。動(dòng)物清醒后采用LongaI`分標準}o分:無(wú)神經(jīng)功能缺損表現;1分:對側前爪不能充分伸展;2分:向外側轉圈;3分:行走時(shí)一向對側傾斜;4分:不能行走，息識喪失)進(jìn)行神經(jīng)功能評分，1-3分者一納入實(shí)驗，0分、4分者一剔除。將納入的手術(shù)動(dòng)物隨機分為3組:模型組、PTS組和尼莫地平組。后兩組動(dòng)物自手術(shù)日開(kāi)始，分別子三七通舒混懸液和尼莫地平混懸液灌胃。給藥劑量按大鼠與人體表ICI積等效劑量折算，前者瓜4ui g 100擴子川I當十成人用量loom g 60kg 1 d-1)的10子R，后者(L.73m g 100g 1 cT1)}I I當十成人用量(120m g 60kg 1 d 1)的BTR}正常組和模型組動(dòng)物自手術(shù)日開(kāi)始給子去離子水灌胃。各組均何天給藥1次，何3天稱(chēng)體質(zhì)量1次以幣新}I-算給藥量，十術(shù)后3d, 7d和28d三個(gè)時(shí)一間點(diǎn)分別取材。觀(guān)察各組大鼠術(shù)后5h, 1d, 2d, 3d時(shí)一的L onga七}`分和術(shù)后當日、3d, 7d, 28d時(shí)一的活動(dòng)度變化。術(shù)后3d, 7d, 28d分別取各組大鼠7只，麻醉后腹卞動(dòng)脈采血，3 000響in離心10m in汾離血清，-200C凍存，采用酶聯(lián)免疫吸附法((E L工SA)測定血清幾-6;用恒流泵依次灌注生理鹽水200m 1, 4%多聚甲醛200m咽定腦組織，切片脫水浸蠟包埋，常規HE染色，光鏡觀(guān)察。

5.統計學(xué)方法采用SPSS10.0 fouwindows統計分析軟件，所有實(shí)驗數據以z士、表不，組間均數的比較經(jīng)方差齊性檢驗后以單因素方差分析統不}一結果。

結果

1.行為學(xué)觀(guān)察

1.1神經(jīng)功能評分見(jiàn)表1。大鼠M CAO術(shù)后多十1-3h內清醒。術(shù)后5h神經(jīng)功能缺損癥狀較幣，L onga評分較高，術(shù)后48h缺損神經(jīng)功能有所恢復，L onga評分呈下降趨勢，術(shù)后72h PTS組和尼莫地平組L onga}`分顯著(zhù)低十模型組，差異有顯著(zhù)統不l一學(xué)b,義中<0.01) o

1.2一般狀態(tài)正常組大鼠精神好，反應靈活，活動(dòng)度大。其余各組術(shù)后3d精神均較差，反應遲鈍，扎堆蜷縮;術(shù)后7d模型組精神、反應及活動(dòng)度仍較差，PTS組和尼莫地平組的狀態(tài)有一定好轉，活動(dòng)度較大，無(wú)扎堆蜷縮;術(shù)后28d，各組大鼠的一般狀態(tài)均接近正常，活動(dòng)度無(wú)明顯差異。

2. HE染色光鏡檢測結果正常組的皮層細胞形態(tài)正常，核仁清楚，神經(jīng)細胞數量多，排列整齊，形態(tài)完整。術(shù)后3d時(shí)一，模型組皮層組織梗死中心區神經(jīng)兒、膠質(zhì)細胞和血管大量壞死，可見(jiàn)少量皺縮神經(jīng)少:和小膠質(zhì)細胞、細胞骨架消失或嚴幣破壞，組織結構疏松呈篩網(wǎng)狀，軟化灶明顯，梗死灶周邊區部分神經(jīng)少:腫脹，胞漿伊紅著(zhù)色變淺，形態(tài)變圓，體積增大，分布不均，另一部分神經(jīng)兒濃縮，核周質(zhì)濃縮著(zhù)色較深，被空泡的神經(jīng)纖維圍繞，神經(jīng)兒形態(tài)變?yōu)槎嘟切位蛏刃?，血管可?jiàn)粒細胞附壁及浸潤;PTS組與尼莫地平組的梗死范圍明顯小十模型組，梗死邊緣組織結構未完全破壞，殘存神經(jīng)兒較多，周?chē)⒃谀z質(zhì)細胞增生，神經(jīng)兒、膠質(zhì)細胞和血管大量變性壞死等缺血性改變和炎性反應明顯輕十模型組。術(shù)后7d時(shí)一，模型組較術(shù)后3d時(shí)一的表現有好轉趨勢，膠質(zhì)細胞增生，細胞數目有所增多。術(shù)后28d時(shí)一，模型組膠質(zhì)細胞明顯增生，細胞數目增多。PTS組與尼莫地平組術(shù)后7d, 28d時(shí)，病理形態(tài)改變顯著(zhù)輕十同期模型組。

3.血清II. - 6水平見(jiàn)表2。模型組血清IL-6水平隨著(zhù)病程的延長(cháng)呈下降趨勢，術(shù)后28d與該組術(shù)后3d比較顯著(zhù)降低(p<0.05),但在3個(gè)時(shí)一間點(diǎn)均高十正常組(P<0.01) o PTS組和尼莫地平組IL.-6的水平隨時(shí)一間的變化趨勢與模型組相似，術(shù)后7d和28d與自身術(shù)后3d比較顯著(zhù)降低，有統不l一學(xué)息義。日‘PTS組和尼莫地

討論

木實(shí)驗通過(guò)研究腦梗死大鼠功能損傷、恢復動(dòng)態(tài)過(guò)程中的腦保護機制和促康復因素等，為PTS用十腦梗死的臨床治療提供了一定實(shí)驗依據。

1.行為學(xué)變化

1.1神經(jīng)功能評分術(shù)后3d, PTS組和尼莫地平組L onga評分顯著(zhù)低十同組術(shù)后5h盼藥前)評分，較同期模型組下降速度快，說(shuō)明兩組均能改善腦梗死后大鼠神經(jīng)功能;術(shù)后7d各組大鼠神經(jīng)功能基木恢復，接近正常水下。以上實(shí)驗結果說(shuō)明，腦梗死后早期應用PTS對神經(jīng)功能恢復有一定幫助，但其恢復機制具體為何，是否為促進(jìn)了神經(jīng)的再生，尚需進(jìn)一步探討。

1.2活動(dòng)度的觀(guān)察術(shù)后3d，各組手術(shù)大鼠活動(dòng)度均較差，扎堆蜷縮;術(shù)后7d, PTS和尼莫地平組大鼠活潑性有明顯改善，模型組狀態(tài)較差;術(shù)后28d,各組整體狀態(tài)均接近正常大鼠，無(wú)明顯差異，提不藥物干預可以加快M CAO大鼠整體狀態(tài)的恢復。

2.病理形態(tài)學(xué)變化木研究所采用的HE染色能初步觀(guān)察腦組織神經(jīng)兒的病理改變。觀(guān)察結果表明，PTS組與尼莫地平組對大鼠缺血的腦組織均有明顯的促恢復作用，中西藥治療組與對應時(shí)一間模型組比較，神經(jīng)兒缺血性損害程度明顯減輕，卞要表現為皮質(zhì)神經(jīng)兒缺血性損害程度減輕，恢復速度加快。

3.血清IL.-6水平大鼠試驗以及臨床研究均已發(fā)現在腦缺血級聯(lián)反應中，有多種細胞因子參與，局部的炎癥反應導致腦缺血缺氧時(shí)一腦細胞的損傷和壞死，同時(shí)一全身血液循環(huán)中炎癥因子也出現相應的變化Ci-s l o是具有多項功能的細胞因子，卞要由T淋巴細胞、B淋巴細胞、單核細胞、內皮細胞產(chǎn)生，在腦組織中產(chǎn)生IL.-6的細胞是星形細胞和小膠質(zhì)細胞0研究已證實(shí)在腦缺氧缺血模型中IL.-6具有神經(jīng)保護作用[n, s7但工L-6產(chǎn)生過(guò)多又可加幣腦細胞損傷。研究表明，缺氧缺血性腦損傷時(shí)一，顱內IL-6水平迅速增高、活性增強，導致腦細胞的水腫和壞死[[6-i]。陳雨振

研究證實(shí)IL-6水平同腦梗死體積和神經(jīng)功能受損程度成正相關(guān)口，是腦損傷恢復期腦梗死體積的獨立預測指標。木實(shí)驗中模型組血清工L-6水平隨著(zhù)病程的延長(cháng)呈下降趨勢，術(shù)后28d與自身術(shù)后3d比較顯著(zhù)降低(p<0.05)，在3個(gè)時(shí)一間點(diǎn)均高十正常組(P < 0.01)。PTS組和尼莫地平組工L-6的水平隨時(shí)一間的變化趨勢與模型組相似，術(shù)后7d和28d與自身術(shù)后3d比較顯著(zhù)降低，日‘PTS組和尼莫地平組在各時(shí)一間點(diǎn)均顯著(zhù)低十同期模型組。升高的IL-6能刺激細胞間%k}l I }}}分子ICAM-1的合成，減少其抗體的表達，使炎性細胞大量聚集在病變區域，增加中性粒細胞在化學(xué)趨化因子的刺激下，釋放氧自由基，與其他炎性細胞因子協(xié)同發(fā)揮細胞毒性作用[[8 ]而PTS和尼莫地平可以降低血清IL.-6水平，這可能是其抑制腦缺血級聯(lián)反應中炎癥過(guò)程、減輕腦缺血損傷的機制，為恢復奠定良好的基礎。

綜上所述，木實(shí)驗研究認為，PTS對急性腦梗死具有較好的治療效果，表現為:改善神經(jīng)功能缺損癥狀;減輕缺血區神經(jīng)兒損害程度;抑制腦缺血級聯(lián)反應中炎癥介質(zhì)的表達等，為臨床應用PTS治療缺血性腦血管疾病提供了一定的實(shí)驗依據。近年來(lái)，關(guān)十中藥提取物治療中風(fēng)的研究蓬勃興起，已在臨床及多種大鼠模型上印證了中藥的療效，治療中風(fēng)的作用機制度也日見(jiàn)清晰。有研究表明PTS可以縮小腦缺血再灌注大鼠的梗死ICI積，抑制細胞凋亡[[8-9]。因此，PTS的作用機制可能為多水平、多通道、多靶點(diǎn)的綜合效應，其對腦缺血損傷的神經(jīng)保護、再生和幣塑作用的實(shí)現途徑尚待進(jìn)一步研究證實(shí)。