鐘振國 屈澤強 鮑運平 王乃平 張鳳芬 張要艷

          (廣西中醫學(xué)院 廣西530001)

摘要:目的探討三七總皂(PNS)對老年性癡呆(AD)模型大鼠空間學(xué)習記憶功能障礙的改善作用。方法以D一半乳糖腹腔注射致亞急性損傷合并鵝膏草氨酸損毀雙側大腦Meynert基底核建立AD大鼠動(dòng)物模型;Mom。水迷宮進(jìn)行學(xué)習記憶能力檢測。結果PNS高、低劑量組大鼠在Morris水迷宮測試中，逃避潛伏期明顯縮短，尋求次數、原平臺象限比、跨越原平臺次數明顯增加，與模型組比較有顯著(zhù)意義(P<0.05)a結論PNS對AD模型大鼠空間學(xué)習記憶損害具有明顯改善作用。

關(guān)鍵詞:三七總皂;老年性癡呆;動(dòng)物模型;Morris水迷宮。水迷宮;學(xué)習與記憶;大鼠

中圈分類(lèi)號:8285. 5

老年性癡呆又稱(chēng)阿爾茨海默病(Alzheimer' sdisease , AD )，是一種大腦神經(jīng)退行性疾病，65歲以上人群發(fā)病率約3%}5%，隨著(zhù)世界人口逐年老化，其發(fā)病率也在不斷上升，但目前仍缺乏有效的防治藥物和方法。三七為五加科多年生草本植物三七Panax notoginseng ( Burk )  F. H.Chen的根，傳統中醫理論認為其性味甘、微苦、溫，歸肝胃經(jīng)，具有化痕、止血、活血定痛之效，現代藥理研究表明，三七對心血管系統、血液系統、免疫系統、神經(jīng)系統等均有不同的藥理作用，而對神經(jīng)系統損害的保護作用尤引人注目。三七的藥理活性成分的研究主要集中在三七皂貳成分和氨基酸。為此，我們應用Morris水迷宮( Morris water maze,  MWM)評價(jià)T三七總皂苷( total saponins of Panax notoginseng, PNS)對由D一半乳糖(D-galactose , D-gal)致亞急性衰老加上鵝膏葷氨酸(ibotenic acid，IBA)損毀腦Meynert基底核(nucleus basalis of Meynert, nbM)所致的AD大鼠模型的學(xué)習記憶能力的保護作用。

 

1實(shí)驗材料

1. 1藥品和試劑

PNS:由云南玉溪維和制藥廠(chǎng)提供;石杉堿甲( huperzin A , Hup一A):上海復旦復華藥業(yè)有限公司生產(chǎn)(批號:030202 ) ; D-gal:上海恒信化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)(批號:20020406 ) ; IBA ; Sigma ChemicalCo. P.0.產(chǎn)品(批號:10k1285)。

1. 2實(shí)驗器材

WDT一2型腦立體定位儀:西安西北光電儀器廠(chǎng)生產(chǎn);Morri。水迷宮設備全套(包括Morri。水迷宮，電腦攝像系統，配套軟件分析系統):北京中科院生理所生產(chǎn)。

2實(shí)驗方法

2. 1動(dòng)物分組、造模與給藥

健康Wistar大鼠90只，其中3月齡15只，為青年對照組(以下稱(chēng)青年組)。15月齡75只，隨機抽取15只用作正常老年對照組(以下稱(chēng)老年組)。其余60只大鼠作為造模鼠。大鼠均由廣西醫科大學(xué)實(shí)驗動(dòng)物中心提供。

動(dòng)物適應性喂養1周后，造模用的60只大鼠腹腔注射0.96% D-gal，生理鹽水(NS)配制，按5 mL/kg體重給藥;青年組和老年組大鼠則腹腔注射等體積NS，每日1次，連續6周。從第7周開(kāi)始進(jìn)行腦內雙側nbM核注射IBA。方法:大鼠以3%戊巴比妥鈉35 m歲kg體重腹腔麻醉，將大鼠固定于腦立體定位儀上，在前自后0. 8 mm，中線(xiàn)旁開(kāi)2. 6 mm,顱骨下8. 2 mm，每側緩慢注射IBA 1 uL ( NS配制，濃度5 g/L)[1]。青年組和老年組在相同腦區內注射等體積NS.2周后，將造模組存活的大鼠隨機分為模型對照組(簡(jiǎn)稱(chēng)模型組),PNS高劑量組(簡(jiǎn)稱(chēng)高劑量組),PNS低劑量組(簡(jiǎn)稱(chēng)低劑量組)和石杉堿甲陽(yáng)性對照組(簡(jiǎn)稱(chēng)石杉堿甲組)。高劑量組以PNS灌胃，200 mg/kg體重給藥;低劑量組以PNS灌胃,100 m歲kg體重給藥;石杉堿甲組以0. 3 m歲kgHup-A灌胃給藥;模型組、青年組和老年組以等體積NS灌胃。各組均每日給藥1次，連續4周，完成造模和治療。

2. 2大鼠學(xué)習與記憶行為測試

采用MWM測試法，進(jìn)行定位航行試驗和空間探索試驗。MWM參照有關(guān)文獻制作[2]。迷宮置于房間的中央，為一圓形不銹鋼水池，直徑200 cm，高50 cm，水深30 cm。將水池等分為4個(gè)象限，在象限3中心放置一平臺，平臺為圓形，直徑11 cm，平臺高29 cm(即平臺低于水面1 cm，稱(chēng)隱藏平臺)。水迷宮正上方2m高處裝有一個(gè)小型攝像機，并與另一房間的錄像機和監視器連接，記錄大鼠的游泳軌跡和游泳時(shí)間。

(1)定位航行實(shí)驗(place navigation ):共進(jìn)行5d，每天分上下午2個(gè)時(shí)間段，每一時(shí)間段每鼠訓練4次。將大鼠面向池壁由4個(gè)人水點(diǎn)放人池中，測其60 s內成功進(jìn)駐平臺(大鼠找到平臺并滯留其上5s為成功進(jìn)駐)所需時(shí)間(即逃避潛伏期，escapelatency )。如在60 s內大鼠不能成功進(jìn)駐平臺，則實(shí)驗者將其引上平臺并令其停留10s，記錄逃避潛伏期為60s，每次訓練間隔時(shí)間為60s。

(2)空間探索試驗( spacial probe test) ; MWM實(shí)驗最后1d，撤除平臺，從原平臺象限對側池壁中點(diǎn)將大鼠放人水中，記錄2 min內大鼠在原平臺象限的游泳時(shí)間和游泳軌跡，計算大鼠跨躍平臺次數及各象限游泳時(shí)間占總時(shí)間百分比。

2. 3評價(jià)指標與統計方法

定向航行實(shí)驗統計量為逃避潛伏期、尋求次數?？臻g探索試驗統計大鼠原平臺象限游泳時(shí)間占總游泳時(shí)間百分比(簡(jiǎn)稱(chēng)原平臺象限比)、跨越原平臺次數。數據以Sl'SS 11. Sfor Window。統計軟件分析，各組間差異采用重復測量多因素方差分析[3-4]及單因素方差分析，方差齊時(shí)用SNK法檢驗，方差不齊時(shí)用Game，一Howell檢驗。

3結果

3. 1定位航行試驗

結果見(jiàn)圖1。

由圖1可見(jiàn)，模型組潛伏期Sd內變化平緩，無(wú)明顯縮短，給藥治療的各組潛伏期隨著(zhù)訓練天數的增加而明顯縮短。說(shuō)明模型組大鼠學(xué)習記憶行為能力明顯受損，藥物對癡呆模型均有一定程度的保護作用。以SNK法進(jìn)一步對各組作兩兩比較，結果見(jiàn)表1.

由表1可見(jiàn)，模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長(cháng)，與其他各組相比均具有顯著(zhù)性差異(P<0.05)，各給藥組與青年組、老年組比較均有顯著(zhù)性差異(P<0. 05 )。模型組與其他各組的尋求次數差異均具有顯著(zhù)性(P < 0. 05 )。低劑量組、石杉堿甲組、高劑量組、老年組、青年組尋求次數均值從小到大依次排列，且兩兩相鄰間比較無(wú)顯著(zhù)差異(P>0.05)，不相鄰間各組兩兩比較均具有顯著(zhù)性差異(P<0.05)03. 2空間探索實(shí)驗結果見(jiàn)表2.

由表2可見(jiàn)，組間兩兩比較(SNK法)結果顯示，跨平臺次數除模型組外其他各組兩兩間均無(wú)顯著(zhù)性差異(P>0.05)，而各組與模型組均有顯著(zhù)性差異(P < 0. 05 )。原平臺象限比模型組較其他各組明顯偏小，差異顯著(zhù)(P<0.05);給藥各組間及與老年組間兩兩無(wú)顯著(zhù)差異(P>0.05)，而與青年組則均有顯著(zhù)性差異(P < 0. 05)。

4討論

AD患者的臨床表現為智力減退、近期記憶缺失，以及相關(guān)行為能力障礙，因此觀(guān)察AD模型及藥物治療效果的重要指標之一，就是對學(xué)習記憶進(jìn)行直接客觀(guān)的評價(jià)。

MWM實(shí)驗是英國心理學(xué)家Morri。于20世紀80年代初設計并用于空間學(xué)習記憶的大腦機制研究領(lǐng)域[5]。就記憶屬性的不同分類(lèi)系統來(lái)看，經(jīng)典MWM所檢測的是大鼠在多次的訓練中形成的一種空間參考記憶，其儲存的機制主要涉及邊緣系統及大腦皮層有關(guān)腦區，屬于陳述性記憶[3]。臨床健忘或癡呆的患者，正是陳述性記憶首先受損而且比較突出[6]。所以從檢測的記憶屬性來(lái)說(shuō)，運用MWM系統進(jìn)行防治此類(lèi)疾病有效藥物的篩選研究是較為恰當的。MWM試驗作為記憶量化的良好方法，其提供的參數眾多，定位航行試驗歷時(shí)Sd，實(shí)驗數據結構龐大且復雜，為準確反映出各組數據間客觀(guān)存在的內在聯(lián)系，統計學(xué)處理采用胡鏡清等[3]推薦的重復測量多因素方差模型進(jìn)行分析處理。

研究證實(shí)[7] , AD患者nbM膽堿能神經(jīng)元大量退行變性，因此采用興奮性毒素損毀nbM可獲得理想的膽堿能缺陷AD模型。本實(shí)驗采用d-gal加速動(dòng)物衰老基礎上合并應用興奮性神經(jīng)毒素IBA損毀大腦雙側nbM核的方法建立AD大鼠模型，在腦組織形態(tài)、生化、臨床病理指標上更加貼近AD實(shí)際病理改變多因素的復雜過(guò)程[8]。實(shí)驗結果顯示，模型組大鼠的各指標均劣于其他各組，差異顯著(zhù)，模型的建立較為成功。

定位航行試驗的Sd訓練中，PNS高劑量組大鼠對平臺的尋求次數明顯提高，較石杉堿甲組及低劑量組差異顯著(zhù)，接近正常老年組水平。在潛伏期的指標分析中，石杉堿甲組數值上略?xún)?yōu)于高、低劑量組，但3組統計學(xué)處理無(wú)顯著(zhù)性差異?？臻g探索試驗各指標中，各給藥組與老年組間兩兩比較無(wú)明顯差別，而與模型組比較均有顯著(zhù)性差別，說(shuō)明各藥物的治療均對模型鼠的學(xué)習記憶能力起到了改善作用，但結合前面的定位航行試驗指標，還不能認為藥物的保護作用使模型鼠的學(xué)習記憶能力恢復到了正常老年鼠水平?？臻g探索試驗各給藥組間及與老年組間兩兩比較無(wú)明顯差異，這可能與大鼠的空間探索策略有關(guān)，老年組大鼠對平臺空間位置有較好的記憶，當其數次跨越原平臺位置而未找到平臺時(shí)，開(kāi)始懷疑其記憶，遂進(jìn)行另外新的探索。對空間探索試驗做探索策略相關(guān)指標分析應是有待改進(jìn)的方法之一。

通過(guò)對PNS影響AD模型大鼠空間學(xué)習記憶的研究發(fā)現，PNS對老年性癡呆模型大鼠學(xué)習記憶功能損害有明顯的改善作用，為三七的臨床新用途提供了參考。