扶芳藤提取物預防給藥對大鼠急性腦缺血再灌注后c-fos表達的影響

肖 健

(廣西中醫學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室,南寧市 530001 )

=摘要> 目的 探討扶芳藤提取物預防給藥對大鼠急性腦缺血再灌注后大腦c-fos表達的影響。方法 Longa法制作急性腦缺血再灌注損傷模型,用免疫組化法檢測腦組織缺血再灌注2、6、12、24 h的c-fos表達水平。

結果 扶芳藤提取物能降低再灌注2、6、12、24 h后大鼠腦組織中c-fos的表達(P<0. 05)。

結論 扶芳藤提取物對大鼠急性腦缺血再灌注損傷的保護作用機制可能與下調缺血腦組織中c-fos表達有關(guān)。

=關(guān)鍵詞> 扶芳藤提取物;腦缺血再灌注損傷; c-fos

=中圖分類(lèi)號> R 743. 31;R 289. 5 =文獻標識碼> A =文章編號> 0253-4304(2007)10-1501-02

Effect of Euonymus fortunei extract on the expression ofc-fos in ratswith cerebral is chem ia-reperfusion injury XIAO Jian(Department ofImmun obiology and Microbiology,Guangxi Tradictional Chinese Medical University,530001China)

=Abstract> Objective To study the effect of extract of Euonymus fortunei (EE) on the expression of c-fos in cerebral ischemia-reperfusion injury rats.M ethods The cerebral ischemia-reperfusion model was prepared by means of Longas' method.The expression of c-fos

were determined by immunohistochemistry.Results The expression of c-foswere decreased in allEE-treated groups after ischemia followed by 2,6,12,24 hours reperfusion.Conclusion The protection ofEE to neuronal injury induced by cerebral ischemia-reperfusion may work by down regulating the expression of c-fos. =Key words> Eutract;Euonymus fortune;i Cerebral ischemia-reperfusion injury; c-fos

扶芳藤[Euonymus fortunei (Turcz. ) Hand#Mazz]是衛矛科衛矛屬植物,主要分布在我國山西、陜西、廣西、云南、貴州、湖南、湖北等地,具有補腎強筋,止血化淤、舒筋活絡(luò )的功能。

多年來(lái)國內對扶芳藤的研究從未間斷,并證明扶芳藤能抑制血栓形成、增進(jìn)超氧化物岐化酶(SOD)活力、延長(cháng)心肌缺氧的存活時(shí)間[1]。本實(shí)驗通過(guò)線(xiàn)栓法制造大鼠急性腦缺血再灌注

模型,利用扶芳藤提取物預防給藥并觀(guān)察其對再灌注損傷過(guò)程中的c-fos表達水平的影響,為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用扶芳藤治療腦缺血疾病探索理論依據。

1 材料與方法

1. 1 藥物與試劑

扶芳藤的提取:取扶芳藤1 kg,加入相當干藥材10倍量的水,在不銹鋼鍋內煮開(kāi)后1 h,過(guò)濾,保留濾液;藥渣再加以8倍于生藥量的水,煮開(kāi)后文火煎30min,過(guò)濾去渣,合并2次濾液,濃縮至相當于原生藥量的容量即1 000 ml時(shí),取出冷卻;然后加入95%食用乙醇,邊加邊攪拌,直至藥液中含乙醇為80%時(shí),放置48 h,在前24 h內攪拌3~4次,后靜置24 h,過(guò)濾去渣,濾液在旋轉回收器中回收乙醇至無(wú)醇時(shí),將無(wú)醇的液體加熱,濃縮成2. 0 g生藥/ml的藥

物,保留于4e冰箱,使用時(shí)再用雙蒸水稀釋成所需濃度。c-fos免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1. 2 給藥方式及途徑

藥物組給予扶芳藤提取物灌胃,灌胃量根據成人每日臨床用量按人與動(dòng)物之間藥物劑量換算:利用mg/kg折算mg/m2轉換因子進(jìn)行計算[2],每100 g大鼠每日藥量為2 mg, 1次/d,共2個(gè)月。

1. 3 動(dòng)物與分組

W istar大鼠60只,雌雄各半, 3~5月齡,體重250~300 g,由廣西醫科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗中心提供,許可證號: SCXK桂2003-0003。隨機分為3組:假手術(shù)組、腦缺血再

灌注模型組(以下簡(jiǎn)稱(chēng)模型組)、腦缺血再灌注給藥組(以下簡(jiǎn)稱(chēng)給藥組),以上各組均按缺血再灌注2、6、12、24 h四個(gè)時(shí)點(diǎn)

分成4個(gè)亞組,每個(gè)亞組5只大鼠,分籠飼養,自由進(jìn)食,喂標準顆粒飼料,飲自來(lái)水。

1. 4 動(dòng)物模型的制作

采用改良Zea Longa,s法[3]制作大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebralartery occulusion,MACO)模型。大鼠用10%水合氯醛(0. 35 ml/100 g)腹腔注射麻醉,仰臥固定,頸部正中線(xiàn)切口,沿胸鎖乳突肌內緣鈍性分離肌肉和筋膜,直到分離出左側頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內動(dòng)脈,用動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉頸內動(dòng)脈,結扎頸外動(dòng)脈近心端及頸總動(dòng)脈,然后在距頸總動(dòng)脈近分叉3~4 mm處剪口,將直徑為0. 24 mm的釣魚(yú)線(xiàn)自切口輕輕插入,插入深度約為(18. 5?0. 5)mm,縫合皮膚,皮外留線(xiàn)長(cháng)約10 mm。缺血2 h后,將釣魚(yú)線(xiàn)向外輕輕拔出10 mm,即可實(shí)現再灌注。

大腦中動(dòng)脈閉塞(MACO)模型制作成功的標準:大鼠蘇醒后表現為: (1)提尾離地時(shí)右前肢內收屈曲; (2)在地板爬行時(shí)向右側劃圈; (3)站立時(shí)向右側傾倒。假手術(shù)組按上術(shù)方法施行,但僅分離至頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內動(dòng)脈后即施行縫合術(shù),不插入釣魚(yú)線(xiàn)。

1. 5 腦片制備

大鼠經(jīng)10%水合氯醛(0. 35 ml/100 g)腹腔注射麻醉后,仰臥固定,常規胸腹聯(lián)合切口,將灌流針頭經(jīng)左心室插入主動(dòng)脈,快速灌入200 ml含有0. 01%肝素的生理鹽水,接著(zhù)滴注400 ml4%多聚甲醛固定液。灌流瓶?jì)鹊囊好鎽嚯x動(dòng)物心臟約高出1 m以使灌流壓略高于動(dòng)物收縮壓。灌流后將動(dòng)物放入裝有4%多聚甲醛固定液的塑料袋中,置4e冰箱內1 h,取出斷頭取腦,大腦置4%多聚甲醛固定液中固定2 h。大腦分別置于20%、30%蔗糖的PBS中(4e)過(guò)夜。次日以冰凍切片機切片,每個(gè)鼠腦約切10片,切片厚度為20Lm,切片貼附于聚賴(lài)氨酸載玻片。保鮮膜密閉片盒,置于-20e保存。

1. 6 指標檢測

c-fos表達的檢測采用免疫組化染色法,嚴格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。400倍光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察,每張切片隨機觀(guān)察8個(gè)視野,胞漿或胞核有棕色顆粒者為c-fos陽(yáng)性細胞。

1. 7 統計學(xué)處理

用SPSS 14. 0 forW indows軟件進(jìn)行統計。各組間比較采用方差分析,所有數據均以x?s表示,P<0. 05為組間差異具有統計學(xué)意義。

2 結 果

2. 1 形態(tài)學(xué)變化 缺血再灌注模型組缺血灶內大量細胞胞漿染成深棕色的c-fos陽(yáng)性細胞,隨再灌注時(shí)間增長(cháng),細胞排列紊亂,細胞周?chē)g隙增寬,有大量缺血壞死神經(jīng)元,胞體腫脹,胞漿淡染,胞核溶解,結構不清;給藥組模型切片中的細胞形態(tài)相對完整、細胞間質(zhì)比較均勻、致密,可見(jiàn)少量c-fos陽(yáng)性細胞。

2.2 扶芳藤提取物對大鼠急性腦缺血再灌注后c-fos表達水平的影響 與假手術(shù)組比較,缺血再灌注模型組、給藥組的c-fos在2、6、12、24 h時(shí)點(diǎn)的表達明顯增高,差異有統計學(xué)意義(P均<0.01);但給藥組在各時(shí)點(diǎn)的表達顯著(zhù)低于模型組,差異有統計學(xué)意義(P均<0.01),見(jiàn)表1。

表1 扶芳藤提取物對大鼠急性腦缺血再灌注后c-fos表達的影響(x?s,% )

Table 1 Effecton expression of c-fos in cerebral ischemia-reperfusion injury ratswith ExtractofEuonymus fortumei

組別2 h 6 h 12 h 24 h

假手術(shù)組1. 42?0. 69 1. 00?0. 58 0. 71?0. 49 0. 86?0. 69

模型組34. 00?2. 83 37. 00?5. 16 30. 43?3. 60 28. 86?4. 26

給藥組13. 86?2. 97 14. 58?2. 76 9. 86?2. 34 9. 14?2. 97

3 討 論

1982年,真核細胞基因組中的原癌基因c-fos被發(fā)現,這是一種即基因( immediate-early gene, IEG),其產(chǎn)物FOS蛋白參與細胞周期的調節,與細胞的生長(cháng)、分化、死亡及損傷修復有關(guān),其主要機制為FOS經(jīng)廣泛修飾后與另一種IEG c-jun所表達的核蛋白JUN形成轉錄激活蛋白1 ( activator protein 1,AP-1),AP-1能與DNA調節序列相結合,可被基因啟動(dòng)子或增強子序列識別并結合,從而參與細胞生長(cháng)、分化等一系列病理生理過(guò)程。因此c-fos作為核內第三信使,在神經(jīng)信號的傳遞中發(fā)揮重要作用。c-fos對缺血再灌注等外界刺激可迅速作出反應進(jìn)行表達,是反映神經(jīng)細胞功能狀態(tài)的重要的因素,其基因產(chǎn)物c-fosmRNA和FOS作為細胞對缺血反應的敏感指標,可用來(lái)評價(jià)腦缺血后神經(jīng)損傷程度,因此c-fos的表達可作為研究腦缺血后細胞代謝改變的一項新指標和測定藥物對腦缺血干涉作用的新方法[4]。

正常情況下c-fos在腦內表達水平極低,腦缺血可誘導其大量表達, c-fos表達與腦缺血后神經(jīng)元的死亡或凋亡呈平行關(guān)系,其表達程度反映了腦缺血后神經(jīng)元死亡的程度, c-fos表達越高,相應的腦組織損傷越嚴重[5]。相關(guān)機制可能是因為c-fos的高度表達后形成的AP-1通過(guò)調控其下游基因,從而使一些維持細胞生存的蛋白合成減少,殺手蛋白合成增多引起[6]。

本實(shí)驗證明扶芳藤提取物能明顯減少c-fos的表達,提示扶芳藤提取物可能是通過(guò)抑制c-fos的表達,從而降低腦缺血區半暗帶的細胞死亡率來(lái)實(shí)現其神經(jīng)細胞保護功能。 因為影響c-fos表達的因素較多,如興奮性氨基酸(EAA)受體激活和細胞內Ca2+增多,以及自由基的增多等等,那么,扶芳藤對腦缺血的保護作用是否是通過(guò)抑制上述因素的增多來(lái)發(fā)揮效應抑或是直接抑制于c-fos來(lái)發(fā)揮效應,還需進(jìn)一步的研究與摸索。